sábado, 2 de junio de 2012

Determinación de Mohos y Levaduras


Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

Generalidades 
(Lo que se debe saber antes de realizar este metodo   :)

El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo.

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación.

Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través de: 

(a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas)
(b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación 
(c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. 
Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos.

Fundamento

El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo selectivo específico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a los polisacáridos que contiene el medio. La hidrólisis de estos compuestos se efectúa por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH ácidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. Así mismo, la  acidificación permite la eliminación de la mayoría de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubación a una temperatura de 25 ± 1 ºC da como resultado el crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos.


 MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

  •      1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%, estéril a.
  •          3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%, estériles con tapón de algodón a.
  •             4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosaa .
  •           4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta a.



SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
  •           Solución colorante de lactofenol azul de algodón b.
  •          Colorantes para tinción de Gram b.
  •        Solución estéril de ácido tartárico al 10.0 % a 

MATERIAL Y EQUIPO 


·         Vaso de licuadora estéril o bolsa para Stomacher
·         Motor para licuadora o Stomacher
·         Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón
·         Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón
·         Pipetas Pasteur estériles
·          Propipeta.
·         Cajas de Petri estériles (una se utiliza para pesar la muestra)
·         Utensilios estériles para la manipulación de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc.
·         Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25±1°C
·         Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica mantenida  a 45±1°C
·         Portaobjetos, cubreobjetos, diurex
·         Microscopio óptico
·         Asa bacteriológica y asa micológica
·         Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador 

PROCEDIMIENTO

1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%.

2. Homogeneizar la muestra con la solución anterior en un vaso de licuadora estéril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la licuadora a velocidad mínima, ó 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad normal. Esta es la dilución primaria.

3. De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir esta operación tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe  tilizar una pipeta estéril para cada dilución.

NOTA
Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un fragmento de hifa o de un cúmulo de hifas. Debido a esto, el número de UFC/mL  uede variar dependiendo de las condiciones de homogeneización de la muestra (a mayor tiempo de homogeneización mayor será la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentarían las UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneización citados en esta metodología son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para este grupo microbiano.
                                                        
4. Colocar por duplicado en cajas Petri estériles, 1.0 mL de cada una de las
diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estéril.

5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estériles. Enfriarlos y mantenerlos a ±45°C.

6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar, 1.4 mL de ácido tartárico al 10% esterilizado por filtración en membrana, o bien esterilizar la solución a 121°C±1°C durante 15 minutos. Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a ±45°C se le deberá adicionar 0.3 mL del ácido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo precaución de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo.

7. Después de la acidificación, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potenciómetro.

8. En cada caja de Petri con inóculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a ±45°C. El tiempo transcurrido entre la preparación de las diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.

9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo  cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejándolas reposar sobre una superficie horizontal fría.

10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verterá en una caja de Petri sin inóculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Después de la incubación estas cajas no deberán presentar desarrollo de colonias.

11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25±1°C.

12. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificación de 4 días de incubación o incluso las de 3 días. En este caso, se informa el período de incubación en los resultados de los análisis.

13. Realizar una tinción húmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodón, para un examen microscópico y una posible identificación de los mohos que se hayan desarrollado.

14. Realizar una tinción de Gram para la observación microscópica de las levaduras obtenidas.

15. Contar las colonias de cada placa representativa, después de 3, 4 y 5 días de incubación (a 26 ± 1ºC o a temperatura ambiente).

16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilución.

17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 25±1°C durante 5 días.

18. Describir las características macroscópicas y microscópicas observadas, de los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada.

19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difícil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 días de incubación y aún a los 3 días. En este caso se debe informar el periodo de incubación de 3 ó 4 días, en los resultados del análisis.


CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Para elaborar un informe de resultados se sugiere seguir las indicaciones que a continuación se expresan:

ANÁLISIS CUANTITATIVO

Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este análisis, se deben seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadística). Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el número de hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado físico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el número de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilución correspondiente a esa caja. En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o levaduras, se debe reportar el número obtenido de UFC indicando la dilución correspondiente.
En el caso de no encontrar colonias características de hongos y/o levaduras, el resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g ó bien menos de 10 UFC/mL (Sensibilidad del Método)
Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar el tiempo de incubación en el que se realizó la cuantificación. Para cualquiera de los casos citados se deberá  reportar por separado el resultado de la cuantificación de hongos y de levaduras. Reportar las observaciones macroscópicas y microscópicas de los diferentes tipos de colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el análisis. Si es posible reportar el o los géneros probables.

Conclusión
Bueno como bien sabemos los mohos y levaduras son microorganismos inteligentes que tienen un gran provecho en los diversos componentes químicos de la carne (como carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas, sales, etc.) así como también en agentes físicos (pH, temperatura, humedad, exposición a la irradiación, etc). Lo cual logran producirse principalmente en estos alimentos cárnicos, utilizando como nutrientes a los polisacáridos que contenga el medio para la muestra en este método de determinación con una acidificación (pH 3.5) que nos indicara las presencia de estos microorganismos. así como las condiciones anaerobias y la incubación a una temperatura adecuada nos brindaras las evidencia de la presencia de mohos y/o levaduras; Claro contando los materiales de laboratorio, soluciones, medios de cultivos, reactivos  y indicadores que nos señalan y nos facilitaran esta evidencia también no hay que olvidar un uso y un seguimiento responsable del proceso de esta determinación para continuar con  un calculo de los resultados del procedimiento para realizar así su análisis y concluir , en las colonias presentes y numero de hongos y levaduras en UFC (Unidades Formadoras de Colonias) en cada gramo y/o mililitro de la muestra para conocer el resultado definitivo. 

BIBLIOGRAFÍA.

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para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.
·         Frazier W. & Westhoff D. (1994) Microbiología de los Alimentos. 4ª. ed.
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·         Beuchat L.R. & Cousin M.A. (2001) “Yeasts and Molds”. In: Compendium of
·         Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito
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·         Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological
·         Criteria. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M.
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·         http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL


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